鸡小肠上皮细胞永生化细胞构建方法及SV40基因检测结果

1.试验所需仪器设备及试剂

（1）仪器

（2）试剂耗材

2.鸡小肠上皮细胞的分离培养

去孵化9day的鸡蛋，蛋壳表面用酒精棉球消毒。

敲开蛋壳，将鸡胚固定于无菌操作板上，取出小肠，置于含抗生素的PBS缓冲液中清洗数次。

将肠管剪成小于1mm3的碎片，转移至50mL的离心管中，加入无血清基础培养基清洗，用移液管反复吹打，1200r/min离心4min。

按上述步骤反复清洗组织块4~5次，直至上清液澄清。

将组织块均匀接种于基质胶包被的T25细胞培养瓶中，加入1mL上皮细胞wan全培养基，将培养瓶倒置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中静置1小时。

翻转培养瓶使其正置，可见培养液浸润组织。

置于培养箱中继续培养，次日显微镜下观察并换液。

后续每天观察，2~3day换液，期间去掉飘起的组织块，直至细胞长满整个瓶底。

细胞培养图片如下：

                   100x                                          200x

原图见文件-细胞培养

3．免疫荧光鉴定

3.1实验步骤

（1）细胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

（2）固定

细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

（3）破膜封闭

将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，

玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，

取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

（4）一抗孵育

一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释

破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）

（5）二抗孵育

室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

（6）包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

鉴定细胞为P1代细胞

3.2免疫荧光鉴定结果

           100X-DAPI                                  100X-fluorescence

            200X-DAPI                                 200X-fluorescence

原图见文件-免疫荧光

4.转染

4.1SV40过表达慢病毒基本信息

4.2转染

（1）将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×105 个，

（2）第二天，待细胞贴壁后，换液，

（3）加入1mLwan全培养基，再加20 μL SV40过表达慢病毒，

（4）混匀后继续培养，

（5）12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，

（6）当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。

细胞转染图片如下：

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原图见文件-转染

5.筛选

5.1杀灭曲线的确定

（1）将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜，

（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，

（3）将含不同浓度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板，

（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，

（5）每天观察细胞的存活比例，

（6）最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的zui低筛选浓度。

结果：嘌呤霉素的使用浓度为1ug/mL，作用时间2d。

5.2嘌呤霉素筛选转染细胞

（1）第一天，将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜

（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，

（3）加入含嘌呤霉素（1ug/mL）的筛选培养基，孵育，

（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，

（5）每天观察细胞的存活比例，

（6）在同一时间点（2d）存活的细胞，即为转染成功的细胞，

（7）对筛选后的细胞进行扩增。

6.细胞扩增

将筛选后的细胞进行扩增，筛选后的细胞为P1代，扩增至少到12代。

永生化的细胞图片如下：

                 100X                                            200X

原图见文件-永生化

鸡小肠上皮细胞永生化细胞Realtime-PCR检测SV40基因

                                                                                                                        图1 扩增曲线

                                                                                 Sample 1为原代鸡小肠上皮细胞；Sample 2为永生化鸡小肠上皮细胞

                                                                                                                                图2 融解曲线

                                                                                         Sample 1为原代鸡小肠上皮细胞；Sample 2为永生化鸡小肠上皮细胞

                                                                                                          图3  SV40基因表达

                                                                      Sample 1为原代鸡小肠上皮细胞；Sample 2为永生化鸡小肠上皮细胞

                                                             表1  各孔Ct值及Tm值

                            Sample 1为原代鸡小肠上皮细胞；Sample 2为永生化鸡小肠上皮细胞